TAHAPAN ISOLASI ENZIM

A.    TAHAPAN ISOLASI ENZIM

Enzim adalah satu atau beberapa gugus polipeptida yang berfungsi sebagai katalis untuk proses biokimia yang terjadi dalam sel maupun luar sel. Contoh subunit enzim adalah protein. Protein merupakan  senyawa organic kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida.

Isolasi Enzim

·          Proses memisahkan enzim dari sumbernya

·         Melibatkan beberapa teknik sekaligus

·         Enzim yang ditemukan di pasaran berasal dari berbagai macam

·         organisme, dengan berbagai tingkat kemurnian, contoh:

·         α-Amilase

·         Glukoamilase

·         Protease

·         Berdasarkan fungsi hayatinya, ada dua jenis enzim :

·         Enzim intraselluler

·         Enzim ekstraselluler (lebih mudah diisolasi)

Berdasarkan fungsi hayatinya, ada dua jenis enzim :

1.      Enzim intraselluler

2.      Enzim ekstraselluler (lebih mudah diisolasi)

Enzim ekstraseluler :

·         Tidak memerluka proses pemecahan dinding sel

Contoh : papain, tripsin

·         Dipisahkan berdasarkan sifat fisik dan kimiawinya.

Cara pemisahan dari sel : dengan penyaringan

·         Enzim yang masih melekat pada dinding sel atau sisa polimer substrat dipisahkan dengna menggunakan senyawa yang dapat melepaskan interaksi ini, misalnya : Triton X100, sodium lauril sulfat, tween 80

Enzim Intraseluler dan enzim yang melekat pada membran:

·         Harus melalui pemecahan sel

·         Stabilitas struktur sel harus tetap dijaga dengan cara :

Pemilihan jenis buffer dan lingkungan media ekstraksi yang sesuai, menjaga suhu ekstraksi, mencegah kontaminasi logam dsb.

·         Sering terkontaminasi oleh protein intraseluler.

ISOLASI ENZIM INTRASELULER

·         Merupakan proses pelepasan enzim dari sel

·         Isolasi enzim dari tumbuhan memiliki tingkat kesulitan yang tinggi, karena:

·         Dinding selnya keras

·         Cenderung menimbun zat-zat racun dalam vakuole (missal fenol), sehingga ketika dinding pecah, racun dan enzim akan bercampur dan berinteraksi.

Cara mengatasi :

1.      Ditambahkan zat pereduksi, seperti β- merkaptoetanol, askorbat, atau tioglikolat

2.      Menggunakan tanaman muda

Isolasi dalam proses produksi enzim meliputi 4 tahapan utama, yaitu :

1.      Pemecahan Sel

2.      Klarifikasi

3.      Presipitasi

4.      Pengeringan dan Proses Lanjutan

1.      Pemecahan Sel

Beberapa Metode Pemecahan Sel Cara Fisik

1. Dengan alat homogenizer, seperti waring blender, atau

hammer mill.

Biasa digunakan untuk memecah dinding sel jaringan hewan dan tumbuhan. Namun Cara ini kurang baik untuk sel mikroba karena dinding selnya lebih keras. Untuk membantu proses pemecahan digunakan : bubuk alumina, pasir atau silica dan Untuk preparat kecil digunakan mortar dan penumbuk, Untuk skala besar digunakan homogenizer atau penggiling bertekanan ditambah bubuk metal sebagai pemecah dengan cara Sel dibasahi dengan buffer untuk mempermudah pemecahan dan dapat ditambah dengan proses agitasi. Letak enzim di dalam sel mempengaruhi waktu pemecahan.

2. Pembekuan dan Pencairan

Jika pasta sel didinginkan pada -20 oC, maka ia akan mengalami perusakan dinding sel akibat anomali air (volume membesar ketika air membeku). Sekitar 50% protein periplasma akan dilepaskan ke dalam medium, tapi hanya ± 10% protein terlarut total. Bila enzim dapat dilepaskan dengan cara ini, umumnya enzim tersebut memiliki derajat kemurnian yang tinggi. Senyawa kriopektan (laktosa, dekstran, rafinosa, gliserol) yang digunakan pada proses pembekuan akan menghambat pemecahan sel. Sel yang sudah tua lebih mudah dipecah daripada sel muda. Bakteri gram negatif lebih mudah dipecah daripada gram Positif.

3. Kejutan Osmosis

Bakteri Gram negatif lebih rentan terhadap perubahan tekanan osmosa yang besar dibandingkan bakteri Gram positif. Bila bakteri diletakkan dalam media dengan tekanan osmosa tinggi (mis. larutan sukrosa20%) sampai dicapai keadaan setimbang, kemudian dipindahkan ke dalam air, maka akan timbul aliran air dari media ke dalam sel, sehingga akan menyebabkan pecahnya dinding sel.

4. Sonifikasi

Caranya yaituSel dalam media cair diberi getaran di atas frekuensi batas pendengaran manusia (> 20kHz, ultrasonik). Getaran ini menimbulkan perapatan dan perenggangan yang menimbulkan perubahan periodik tekanan dalam cairan medium dan plasma sel.

5. Agitasi dengan Abrasi

Pasta ditempatkan pada wadah yang mengandung butir-butir gelas dan digetarkan dengan cepat. Timbulnya gaya gesek akibat gradien kecepatan oleh tumbukan antar butiran dan antara butiran dengan mikroorganisme menyebabkan pecahnya sel.

Ekstraksi Secara Kimia

Perbedaannya yaitu lebih halus dari cara fisik dan Agitasi diterapkan hanya sekali-kali.

1. Detergent

Detergent-detergent anionik, kationik, dan nonionik cukupefektif untuk merusak membran sel. Contoh detergent yang sering digunakan untuk isolasi enzim : setiltrimetil amonium bromida (kationik), natrium laurel sulfat (anionik), tweens, spans dan triton (non-ionik)

Pada kondisi pH dan kekuatan ion yang sesuai, detergent akanberinteraksi dengan lipoprotein untuk membentuk misel. Akibatnya lipoprotein yang merupakan konstituen membrane dapat larut dan enzim dapat dikeluarkan. Pemilihan dan penggunaan detergent ini harus cukup selektif, karena beberapa enzim dapat menjadi tak aktif akibat denaturasi protein dan pengendapan oleh detergen. Umumnya detergent harusa segera dipisahkan sebelum enzim hasil isolasi digunakan.

2. Enzim Litik

Pemecahan dinding sel dengan cara ini merupakan cara yang paling efektif. Enzim litik yang umum digunakan adalah lisozim yang diperoleh dari putih telur. Enzim ini memecah ikatan -1,4 glikosida dari polisakarida (asam muramat) penyusun dinding sel. Dinding sel bakteri gram positif lebih banyak mengandung polisakarida dibandingkan dengan bakteri gram negatif, sehingga penggunaan enzim litik lebih efektif untuk memecah dinding sel bakteri gram positif. EDTA perlu ditambahkan pada media sebelum enzim ini digunakan untuk memecah dinding sel bakteri gram negatif, untuk mengikat ion-ion divalen yang dapat menginaktifkan enzim ini. Enzim lisozim sudah digunakan secara komersial pada ekstraksi enzim glukosa isomerase dari Streptomyces sp.

2.      Klarifikasi

Proses pemisahan partikel non enzim yang tercampur dengan enzim dengan cara pengendapan. Partikel non enzim berasal dari penambajan buffer, air atau cairan fisiologis pada proses pemecahan dinding sel, atau molekul-molekul kompleks yang berikatan dengan enzim. Dapat dilakukan dengan penambahan senyawa yang dapat menggumpalkan seperti : amonium fosfat, asam askorbat, garam-garam kalsium, serat selulose, sistein, tanah diatom, gelatin, asam fosfat, garam Na-pospat, na-sulfat dan Na-sitrat, atau senyawa penggumpal dalam pemurnian air(polielektrolit seperti poliamin). Menggumpalkan struktur koloid cairan. Dapat ditambahkan bahan pengawet pada tingkat yang aman untuk dikonsumsi, misal : fenol, amonium kuartener dan florida. Dan Enzim hasil klarifikasi dapat dijual sebagai cairan enzim

komersial. Konsentrasi senyawa penggumpal harus tepat, agar enzim tidak ikut menggumpal Garam amonium sulfat pada konsentrasi tinggi menyebabkan salting out protein termasuk enzim.

3.      Presipitasi

Pengendapan dilakukan berdasarkan pada perbedaan kelarutan. Dalam larutan garam yang pekat, biasanya amonium sulfat, protein-protein memiliki perbedaan kelarutan.  Konsentrasi amonium sulfat, protein-protein dapat dipisahkan. Teknik ini sering digunakan pada tahap awal pemurnian protein. Secara umum Protein kecil lebih larut dari pada protein besar. Dan Semakin banyak jumlah muatan pada rantai samping, kelarutan protein semakin besar. Kelarutan protein A sama sekali tidak tergantung pada protein B – kelarutan hanya tergantung pada sifat masing-masing individu protein.

2 jenis metode untuk menggumpalkan enzim :

a.       Pelarut organic

·         Menurunkan konstanta dielektrik

·         medium kurang sesuai dengan permukaan enzim yang polar

·         adanya redsidu asam amino hidrofobik yang terikat secara longgar

·         pada molekul enzim menyebabkan pelipatan molekul baru dan menjadi tidak aktif

·         Proses inaktivasi enzim mungkin terjadi

·         memperbesar kemungkinan denaturasi terutama pada suhu tinggi

·         fraksinasi dilakukan pada suhu rendah.

·         Mudah terbakar dan harganya mahal.

b.      Garam

Pengendapan Dengan Garam

Ion garam mempengaruhi kelarutan protein. Pada konsentrasi rendah ion-ion garam melingkungi molekul protein dan mencegah bersatunya molekul protein sehingga protein melarut disebut SALTING IN

Pada konsentrasi tinggi, terjadi peningkatan muatan listrik di sekitar protein yang akan menarik mantel air dari koloid protein. Interaksi hidrofobik dianatra sesama molekul protein pada suasana ionik akan menurunkan kelarutan protein disebut SALTING OUT.

Salting out dengan garam merupakan proses pemisahan yang murah.

Enzim-enzim dan beberapa protein mempunyai kemampuan untuk membentuk garam dengan penambahan logam. Terbentuknya garam akan menurunkan kelarutan protein ion garam yang ditambahkan mempengaruhi kelarutan protein.

Pengendapan dengan Pelarut Organik

Pelarut organik akan mengurangi tetapan dielektrik air, dengan demikian dapat mengurangi kelarutan protein karena interaksi antar molekul protein lebih disukai dibandingkan antara molekul protein dengan air. Atau dengan kata lain: “Protein diendapkan karena desakan pelarut organik terhadap air yang berinteraksi

dengan protein”. Protein dapat diendapkan dengan pelarut organik tanpa merusak

struktur protein bila diendapkan pada suhu di bawah 4 oC. Pelarut organik yang biasa digunakan a.l. : isopropanol, metanol, etanol dan aseton. Penggunaan pelarut-pelarut ini dalam skala industri jarang digunakan karena selain mudah terbakar juga harganya mahal

1.      Etanol : terdapat keseimbangan antara efek melarutkan dan sifat hidrofilik yang cukup untuk mengurangi denaturasi.

2.      Isopropanol : digunakan untuk presipitasi enzim ekstraseluler seperti amiloglukooksidase, mempunyai sifat mudah terbakar dan cenderung hidrofobik.

3.      Aseton : harus ditambahkan secara perlahan melalui sisi samping wadah

4.      Enzim yang diperoleh dari pelarut organik bersifat lebih murni, meski

4.      Pengeringan dan Proses Lanjutan

Bentuk-bentuk enzim komersial :

·         Bentuk cair

·         Bentuk padat : tepung/serbuk, tablet

·         Bentuk imobil

Enzim cair : diperoleh dengan pemekatan dengan :

·         evaporasi vakum

·         Pemanas/oven

Proses penguapan harus pada suhu yang tidak merusak struktur dan fungsi hayati enzim. Enzim termofil tahan pada suhu 60oC Untuk menghindari kerusakan pada suhu tinggi ditambah senyawa penstabil. Pengeringan vakum umumnya untuk skala lab, karena untuk skala industri terlalu mahal. Pengeringan skala industri : spray dryer

Kelemahan spray dryer :

·         Mahal

·         Dapat merusak aktivitas enzim

·         Kontaminan yang ada pada cairan enzim sebelumnya akan terikat dan tidak dapat dipisahkan

Kelebihan spray dryer : enzim mudah larut dalam air

Gambar. Contoh ekstraksi enzim Mikrobial dan Fermentasi Cair

Pengeringan Enzim dengan Ekstrusi

Proses ini dibantu dengan peralatan khusus untuk membuat bentuk yang lebih seragam. Untuk dapat melewati alat ekstrusi enmzim dicampur dengan bahan pengisi dan pengental sehingga terbentuk pasta enzim

Contoh bahan pengental : CMC

Syarat bahan pengental : tidak reaktif