PEMURNIAN ENZIM

Tujuan dari pemurnian enzim adalah mengisolasi enzim spesifikasi dan ekstra sel “Mentah” (crude) yang mengandung banyak komponen lain. Molekul-molekul kecil dapat disingkirkan lewat dialisis atau filtrasi gel, asam nukleat melalui pengendapan dengan antibiotik streptomisin, dan seterusnya. Pemurnian enzim dan sumbernya yang alami merupakan hal yang penting, khususnya guna mengidentifikasi sifat serta peran modifikasi postranslasi yang berfungsi mengatur lokasi enzim serta efisiensi katalik.

Pada pemurnian enzim intrseluler diperlukan pemecahan sel terlebih dahulu. Hal ini dapat dilakukan dengan cara ekstraksi fisik maupun ekstraksi kimia. Secara fisik antara lain dengan ekstraksi menggunakan alat homogonizer seperti wairing blender atau hammer mill. Cara ini kurang baik untuk sel mikroba karena dinding selnya lebih keras. Metode lain adalah dengan pembekuan dan pencairan. Pasta sel didinginkan pada suhu -20⁰ C yang kemudian mengalami kerusakan dinding sel akibat anomaly air (volume membesar ketika air membeku). Sekitar 50% protein periplasma akan dilepaskan ke dalam medium, tapi hanya sekitar 10% protein terlarut total. Bila enzim dapat dilepaskan dengan cara ini maka umumnya enzim tersebut memiliki derajat kemurnian tinggi. Sedangkan ekstraksi secara kimia dapat dilakukan dengan enzim litik. Enzim ini memcah ikatan b-1,4 glikosida dari polisakarida (asam muramat) penyusun dinding sel. Pemecahan dinding sel melalui metode ini merupakan cara paling efektif. Enzim litik yang umum digunakan adalah lisozim yang diperoleh dari putih telur.

Pemurnian enzim lebih banyak dilakukan pada enzim ekstraseluler karena mudah didapat dari raw material dan bersifat lebih stabil. Enzim ekstraseluler dapat dimurnikan dari substratnya dengan: sentrifugasi, filtrasi, floakulasi dan koagulasi, pengendapan, ultrafiltrasi dan osmosa balik, kromatografi.

Sentrifugasi

Metode ini dipilih untuk memisahkan larutan dari molekul yang lebih besar dalam skala laboratorium. Sentrifugasi jarang digunakan dalam skala besar atau industri karena kapastitasnya yang kecil dan dibutuhkan kecepatan yang sangat tinggi. Diameter partikel yang besar, perbedaan massa jenis partikel dan larutan besar, serta viskositas larutan yang rendah akan mempermudah terjadinya pemisahan. Kecepatan sudut yang tinggi, radius putaran yang besar, dan lapisan cairan yang tipis dapat mempercepat proses. Biasanya partikel materi biologis berukuran kecil dengan massa jenis yang rendah sementara pada hasil fermentasi memiliki viskositas yang tinggi dan kadang memiliki massa jenis yang tinggi. Pada skala laboratorium hal ini dapat diatasi dengan menaikkan kecepatan sudut.

.Digambarkan dengan persamaan

Filtrasi

Filtrasi merupakan pemisahan padatan dari sejumlah larutan melalui sebuah penyaring sehingga paertikel padat akan tertahan di penyaring tadi. Kecepatan aliran cairan yang melewati penyaring bergatnung pada perbedaan tekanan, hambatan oleh materi, kekentalan cairan, dan hambatan oleh lapisan yang sudah terbentuk. Hal ini menyebabkan keefektifan penyaringan yang mula-mula tinggi menurun drastis dengan semakin banyaknya materi yang tersaring. Biasanya digunakan tanah diatomae yang membantu menahan partikel-partikel halus untuk mengatasi masalah tadi.

Penyaring yang biasa dipakai merupakan filter press dan rotary drum filter. Filter terdiri dari kain saring yang terletak di antara dua piringan berombak. Piringan tersebut akan menahan cairan di dalam kain saring dan keluar melalui pori-pori kain saring. Rotary drum filter juga menggunakan tekanan dan perputaran tong akan membantu mengurangi akumulasi endapan pada penyaring

Flokulasi dan koagulasi

Teknik ini baik digunakan sebelum senrtifugasi atau filtrasi. Pada ciran yangsangat encer, flokulasi terjadi dengan penambahan suatu reagen. Koagulasi merupakan adhesi spontan antarpartikel bila muatan partikel yang satu dapat dinetralkan oleh muatan partikel lain. Teknik ini dapat diterapkan untuk pengendapan sel utuh , pecahan sel, atau larutan protein.

Ultrafiltrasi dan Osmosa Balik

Pada ultrafiltrasi, molekul-molekul dipaksa melewati suatu membran dengan ukuran pori sangat kecil dengan menggunakan tekanan hidarulik. Pada osmosa balik ukuran pori sedemikian kecilnya sehingga yang dapat menembus melalui membrane hanya molekul-molekul pelarut. Osmosa balik sering dipakai untuk pemekatan enzim sedangkan ultrafiltrasi digunakan untuk fraksionasi protein berdasarkan ukurannya.

Membran ultrafiltrasi dibedakan menjadi dua macam:

1.      Membran microporous

Merupakan membrane yang kaku dengan diameter pori 500-5000 A­⁰ . Molekul dengan ukuran sangat kecil akan melewati membrane sedangkan molekul besar akan ditahan pada permukaan membrane. Molekul dengan ukuran sedang seringkali ditahan di dalam struktur membrane sehingga sering menyebabkan penyumbatan.

2.      Membran difusif

Membrane difusif terdiri dari membrane hidrogel yang homogen. Melalui membrane-membran ini pelarut dan zat terlarut dipindahkan karena adanya gradient konsentrasi (melalui difusi molekul). Proses perpindahan molekul melalui membran memerlukan energi kinetik dan berlangsung lebih cepat pada temperature yang tinggi.

Kromatografi

Kromatografi merupakan cara pemisahan berdasarkan perbedaan interaksi antara komponen-komponen yang akan dipisahkan dengan fasa diam dan fasa gerak.

1.      KROMATOGRAFI GEL FILTRASI

Prinsip dari teknik filtrasi gel (kromatografi filtrasi gel) adalah pemisahan molekul berdasarkan perbedaan ukurannya. Perlakuan enzim selanjutnya adalah pemurnian berdasarkan ukuran dengan kolom kromatografi filtrasi gel menggunakan sephadex G-100. Sampel diteteskan pada bagian atas kolom gel sephadex G-100 yang berfungsi sebagai fase diam dan larutan buffer fosfat pH 8 yang berfungsi sebagai fase gerak. Sampel enzim yang memiliki bobot molekul lebih besar dari pori-pori gel akan melewati ruang antar pori-pori sehingga akan lebih dahulu keluar dari kolom sebaliknya yang berbobot molekul lebih kecil akan masuk ke dalam pori-pori matriks sehingga akan keluar lebih lambat. Setelah proses kolom berlangsung, eluen ditampung pada wadah sebesar 15 ml. Eluen yang telah ditampung pada wadah kemudian diukur kadar protein dan aktivitas enzimnya.

Gambar 1. Perbedaan prinsip kerja gel filtrasi dan gel penukar ion

2.      KROMATOGRAFI PENUKAR ION

Dalam kromatografi kolom penukar ion terdapat dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Syarat-syarat bahan yang bisa digunakan untuk fasa diam adalah tidak terlarutpada fasa gerak, stabil pada kondisi proses yang dikehendaki dan mampu menyerap zat-zat yang dipisahkan. Sedangkan bahan yang bisa dipakai sebagai fasa gerak harus mempunyai sifat - sifat tidak melarutkan fasa diam, stabil terhadap kondisi proses dan mampu melepaskan atau melarutkan unsur - unsur atau ion - ion yang terserap/terikat pada fasa diamnya, dengan besar kelarutan yang berbeda - beda. Bahan yang dipakai untuk fasa diam adalah resin penukar ion. Resin penukar ion ini dapat menyerap ion – ion yang dipisahkan, dengan menukarkan ion - ion yang sesuai antara ion fasa diamnya dengan ion pada fasa geraknya. Dalam proses pertukaran ion, fasa gerak bertugas mengambil kembali ion-ion yang terkait pada penukar ion dengan jalan mengalirkannya melalui tumpukan penukar ion. Pada umumnya proses ini berlangsung pada sebuah kolom, dan fasa gerak ini dialirkan dari atas ke bawah dengan kecepatan tertentu,sehingga mampu menyebabkan reaksi pertukaran ion ketika fasa gerak mengalir melalui tumpukan resin penukar ion.

Proses pengikatan (adsorbsi) ion yang akan dipisahkan oleh penukar ion disebut dengan pembebanan, sedangkan reaksi pelepasan kembali ion-ion yang terserap padapenukar ion oleh fasa gerak disebut dengan elusi, dan fasa geraknya sendiri disebut eluen. Elusi sangat menentukan keberhasilan proses pemisahan antara ion yang satu dengan iondengan ion yang lain. Proses pemisahan terjadi ketika ion - ion bergerak turun secara berurutan eluat bersama-sama dengan eluen dengan kecepatan yang berbeda yang tergantung pada esarnya koefisien distribusi masing-masing ion. Perbedaan kecepatan migrasi merupakan dasar pemisahan kromatografi. Tanpa perbedaan kecepatan migrasi tidak mungkin terjadi pemisahan. Perbedaan kecepatan migrasi merupakan hasil distribusi keseimbangan senyawa - senyawa fasa diantara fasa diam dan fasa gerak.

Resin penukar ion dapat digunakan dalam metode pemisahan atau pemekatan dengan menggunakan penukaran kesetaraan. Resin penukar ion merupakan polimer tinggi organik yang mengandung gugus fungsional ionik,resin ada umumnya adalah polimer berupa butiran dengan berbagai ukuran.Butiran-butiran ini ditempatkan dalam tabung glass yang cukup panjang sehingga menghasilkan kolom ion penukar ion yang didalamnya akan terjadi proses penyetaraan. Pembuatan resin adalah dengan cara memasukkan gugus yang diionisasi kedalam matriks polimer organik, yang paling umum adalah polistirena yang bertindak sebagai adsorben. Larutan yang melalui kolom disebut influent,sedangkan larutan yang keluar dari kolom disebut efluen. Proses pertukarannya ialah serapan dan mengembalikan resin yang sudah terpakai kebentuk semula yang disebut dengan regenerasi. Sedangkan proses pengeluaran ion dari kolomdengan reagen yang sesuai disebut elusi. kapasitas pertukaran total ialah jumlah gugusan-gugusan yang dapat dipertukarkan didalam kolom dinyatakan dalam milleknalen, kapasitas penerobosan didefinisikan sebagai banyaknya ion yang dapat diambil oleh kolom pada kondisi pemisahan.

Analisis elusi mempunyai berbagai keuntungan, misalkan semua ion-ion yang akan dipisahkan meninggalkan kolom sebagai fraksi-fraksi yang terpisah. Proses elusi terdiri dari dua, yang pertama adalah fraksi dengan beberapa eluen dan yang kedua adalah mengelusi ion yang masih aktif. Resin anionik adalah suatu bahan yang dapat menukar atau mengganti anion-anion yang ada dalam medium disekitarnya. Resin-resin (sintetik) dapat berasal dari polimer-polimer padat yang berjalinan erat secara silang dengan berat molekul besar dapat berasal dari zat organik tertentu seperti fenol dan sterina yang berkaitan dengan gugus tertentu yang dapat terionisasi serta bersifat basa, misalnya gugus amina atau fenol atau aluminium kuartener yang ditambahkan pada resin polifeniletana yang stabil.

Prinsip dasar resin penukar anion adalah dapat ditukarnya anion hidroksil oleh anion lain yang terjadi pada resin penukar ion. ada dua jenis penukaranion yaitu resin yang memiliki gugus basa kuat (gugus amonium kuartener) dan resin yang memiliki gugus basa lemah (gugus anion). Permukaan basa kuat dapat digunakan diatas rentangan pH 0 sampai 12,sedangkan resin penukar basa lemah hanya diatas rentangan pH 0 sampai 9.Golongan penukar basa lemah tidak akan melepaskan asam yang sangat lemah,tetapi lebih disukai untuk asam kuat yang mungkin tertahan oleh resin basa kuat seperti sulfanol.Proses pertukaran ion merupakan proses kompetisi antara ion solut yang terdapat dalam fase mobil dengan ion lawannya yang terikat pada gugusfungsional pada matrik yang bermuatan berlawanan. Hal ini berarti ion solut harusdapat menggantikan satu atau lebih ion lawan yang terikat oleh fasa stationer (matrik). Bila kita mempunyai penukar ion yang bermmuatan positif atau penukar kation yang telah mengikat ion lawan dalam fase mobil yang terdapat pada ionsolut maka proses pertukaran ion dapat beraksi.

3.      KROMATOGRAFI AFINITAS

Pemurnian enzim atau protein menggunakan teknik kromatografi afinitas pada saat ini sangat populer dan menjadi pilihan utama. Pemurnian ini dilakukan berdasarkan afinitas enzim atau protein terhadap biomolekul lain (ligan), misalnya enzim terhadap inhibitor, substrat atau produknya, afinitas antibodi terhadap antigennya, atau afinitas hormon terhadap reseptornya.

Prinsip kromatografi afinitas adalah pengikatan spesifik ligan dengan reseptor. Jadi, dalam kromatografi afinitas minimum harus ada dua senyawa yang berikatan spesifik. Dalam proses pemurnian satu tahap menggunakan kromatografi afinitas diperlukan interaksi spesifik antara protein rekombinan dengan suatu ligan. Keterbatasan metode ini adalah protein rekombinan yang akan dimurnikan harus berinteraksi secara spesifik dengan suatu ligan. Jadi, jika tidak diketahui ligan yang dapat berinteraksi secara spesifik maka tidak dapat dilakukan pemurnian satu tahap.

Ciri yang menonjol pada kromatografi afinitas adalah kemampuannya untuk secara selektif mengeluarkan satu protein tertentu, atau yang paling sering,sejumlah kecil protein tertentu, dari campuran protein yang kompleks. Teknik ini menggunakan suatu ligand tak bergerak yang mengadakan interaksi spesifik dengan enzim yang ingin dimurnikan. Protein yang tidak di kehendaki akan mengalir lewat kolom dan dibuang. Protein yang di kehendaki kemudian akan dielusikan dari ligan yang tak bergerak memakai cairan elusi yang umumnya berupa larutan garam atau ligand berbentuk larut dengan konsentrasi tinggi. Permunian yang dicapai melalui teknik kromatografi afinitas ini sangat mengesankan dan sering melebihi hasil yang mungkin di peroleh dengan pemakaian sejumlah teknik klasik secara berturutan