Senin, 19 November 2012
Senin, 12 November 2012
PEMURNIAN ENZIM
Tujuan dari pemurnian enzim adalah
mengisolasi enzim spesifikasi dan ekstra sel “Mentah” (crude) yang
mengandung banyak komponen lain. Molekul-molekul kecil dapat disingkirkan lewat
dialisis atau filtrasi gel, asam nukleat melalui pengendapan dengan
antibiotik streptomisin, dan seterusnya. Pemurnian enzim dan sumbernya yang
alami merupakan hal yang penting, khususnya guna mengidentifikasi sifat serta
peran modifikasi postranslasi yang berfungsi mengatur lokasi enzim serta
efisiensi katalik.
Pada
pemurnian enzim intrseluler
diperlukan pemecahan sel terlebih dahulu. Hal ini dapat dilakukan dengan cara
ekstraksi fisik maupun ekstraksi kimia. Secara fisik antara lain dengan ekstraksi
menggunakan alat homogonizer seperti wairing blender atau hammer mill. Cara ini
kurang baik untuk sel mikroba karena dinding selnya lebih keras. Metode lain
adalah dengan pembekuan dan pencairan.
Pasta sel didinginkan pada suhu -200 C yang kemudian mengalami
kerusakan dinding sel akibat anomaly air (volume membesar ketika air membeku).
Sekitar 50% protein periplasma akan dilepaskan ke dalam medium, tapi hanya
sekitar 10% protein terlarut total. Bila enzim dapat dilepaskan dengan cara ini
maka umumnya enzim tersebut memiliki derajat kemurnian tinggi. Sedangkan ekstraksi secara kimia dapat dilakukan
dengan enzim litik. Enzim ini
memcah ikatan b-1,4 glikosida dari polisakarida (asam muramat) penyusun dinding
sel. Pemecahan dinding sel melalui metode ini merupakan cara paling efektif.
Enzim litik yang umum digunakan adalah lisozim yang diperoleh dari putih telur.
Pemurnian
enzim lebih banyak dilakukan pada enzim
ekstraseluler karena mudah didapat dari raw material dan bersifat lebih
stabil. Enzim ekstraseluler dapat dimurnikan dari substratnya dengan:
sentrifugasi, filtrasi, floakulasi dan koagulasi, pengendapan, ultrafiltrasi
dan osmosa balik, kromatografi.
Sentrifugasi
Metode
ini dipilih untuk memisahkan larutan dari molekul yang lebih besar dalam skala
laboratorium. Sentrifugasi jarang digunakan dalam skala besar atau industri
karena kapastitasnya yang kecil dan dibutuhkan kecepatan yang sangat tinggi.
Diameter partikel yang besar, perbedaan massa jenis partikel dan larutan besar,
serta viskositas larutan yang rendah akan mempermudah terjadinya pemisahan.
Kecepatan sudut yang tinggi, radius putaran yang besar, dan lapisan cairan yang
tipis dapat mempercepat proses. Biasanya partikel materi biologis berukuran
kecil dengan massa jenis yang rendah sementara pada hasil fermentasi memiliki
viskositas yang tinggi dan kadang memiliki massa jenis yang tinggi. Pada skala
laboratorium hal ini dapat diatasi dengan menaikkan kecepatan sudut.
.Digambarkan dengan persamaan
Filtrasi
Filtrasi
merupakan pemisahan padatan dari sejumlah larutan melalui sebuah penyaring
sehingga paertikel padat akan tertahan di penyaring tadi. Kecepatan aliran
cairan yang melewati penyaring bergatnung pada perbedaan tekanan, hambatan oleh
materi, kekentalan cairan, dan hambatan oleh lapisan yang sudah terbentuk. Hal
ini menyebabkan keefektifan penyaringan yang mula-mula tinggi menurun drastis
dengan semakin banyaknya materi yang tersaring. Biasanya digunakan tanah
diatomae yang membantu menahan partikel-partikel halus untuk mengatasi masalah
tadi.
Penyaring
yang biasa dipakai merupakan filter press dan rotary drum filter. Filter
terdiri dari kain saring yang terletak di antara dua piringan berombak.
Piringan tersebut akan menahan cairan di dalam kain saring dan keluar melalui
pori-pori kain saring. Rotary drum filter juga menggunakan tekanan dan
perputaran tong akan membantu mengurangi akumulasi endapan pada penyaring
Flokulasi
dan koagulasi
Teknik
ini baik digunakan sebelum senrtifugasi atau filtrasi. Pada ciran yangsangat
encer, flokulasi terjadi dengan penambahan suatu reagen. Koagulasi merupakan
adhesi spontan antarpartikel bila muatan partikel yang satu dapat dinetralkan
oleh muatan partikel lain. Teknik ini dapat diterapkan untuk pengendapan sel
utuh , pecahan sel, atau larutan protein.
Ultrafiltrasi
dan Osmosa Balik
Pada
ultrafiltrasi, molekul-molekul dipaksa melewati suatu membran dengan ukuran
pori sangat kecil dengan menggunakan tekanan hidarulik. Pada osmosa balik
ukuran pori sedemikian kecilnya sehingga yang dapat menembus melalui membrane
hanya molekul-molekul pelarut. Osmosa balik sering dipakai untuk pemekatan
enzim sedangkan ultrafiltrasi digunakan untuk fraksionasi protein berdasarkan
ukurannya.
Membran
ultrafiltrasi dibedakan menjadi dua macam:
1. Membran microporous
Merupakan
membrane yang kaku dengan diameter pori 500-5000 A0 . Molekul
dengan ukuran sangat kecil akan melewati membrane sedangkan molekul besar akan
ditahan pada permukaan membrane. Molekul dengan ukuran sedang seringkali
ditahan di dalam struktur membrane sehingga sering menyebabkan penyumbatan.
2. Membran difusif
Membrane difusif terdiri dari membrane hidrogel yang
homogen. Melalui membrane-membran ini pelarut dan zat terlarut dipindahkan
karena adanya gradient konsentrasi (melalui difusi molekul). Proses perpindahan
molekul melalui membran memerlukan energi kinetik dan berlangsung lebih cepat
pada temperature yang tinggi.
Kromatografi
Kromatografi
merupakan cara pemisahan berdasarkan perbedaan interaksi antara
komponen-komponen yang akan dipisahkan dengan fasa diam dan fasa gerak.
1. KROMATOGRAFI
GEL FILTRASI
Prinsip
dari teknik filtrasi gel (kromatografi filtrasi gel) adalah pemisahan molekul
berdasarkan perbedaan ukurannya. Perlakuan enzim selanjutnya adalah pemurnian
berdasarkan ukuran dengan kolom kromatografi filtrasi gel menggunakan sephadex G-100.
Sampel diteteskan pada bagian atas kolom gel sephadex G-100 yang berfungsi
sebagai fase diam dan larutan buffer fosfat pH 8 yang berfungsi
sebagai fase gerak. Sampel enzim yang memiliki bobot molekul lebih besar
dari pori-pori gel akan melewati ruang antar pori-pori sehingga akan lebih
dahulu keluar dari kolom sebaliknya yang berbobot molekul lebih kecil akan
masuk ke dalam pori-pori matriks sehingga akan keluar lebih lambat. Setelah
proses kolom berlangsung, eluen ditampung pada wadah sebesar 15 ml. Eluen yang
telah ditampung pada wadah kemudian diukur kadar protein dan aktivitas
enzimnya.
Gambar 1. Perbedaan prinsip kerja gel filtrasi dan gel
penukar ion
2. KROMATOGRAFI
PENUKAR ION
Dalam kromatografi kolom penukar ion
terdapat dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Syarat-syarat bahan yang
bisa digunakan untuk fasa diam adalah tidak terlarutpada fasa gerak, stabil
pada kondisi proses yang dikehendaki dan mampu menyerap zat-zat yang
dipisahkan. Sedangkan bahan yang bisa dipakai sebagai fasa gerak harus mempunyai
sifat - sifat tidak melarutkan fasa diam, stabil terhadap kondisi proses dan mampu
melepaskan atau melarutkan unsur - unsur atau ion - ion yang terserap/terikat pada fasa
diamnya, dengan besar kelarutan yang berbeda - beda. Bahan yang dipakai untuk
fasa diam adalah resin penukar ion. Resin penukar ion ini dapat menyerap ion –
ion yang dipisahkan, dengan menukarkan ion - ion yang sesuai antara ion fasa
diamnya dengan ion pada fasa geraknya. Dalam proses pertukaran ion, fasa gerak
bertugas mengambil kembali ion-ion yang terkait pada penukar
ion dengan jalan mengalirkannya melalui tumpukan
penukar ion. Pada umumnya proses ini berlangsung pada sebuah kolom,
dan fasa gerak ini dialirkan dari atas ke bawah dengan kecepatan
tertentu,sehingga mampu menyebabkan reaksi pertukaran ion ketika fasa gerak
mengalir melalui tumpukan resin penukar ion.
Proses pengikatan (adsorbsi) ion
yang akan dipisahkan oleh penukar ion disebut dengan
pembebanan, sedangkan reaksi pelepasan kembali ion-ion yang terserap padapenukar
ion oleh fasa gerak disebut dengan elusi, dan fasa geraknya sendiri disebut
eluen. Elusi sangat menentukan keberhasilan proses pemisahan antara ion yang
satu dengan iondengan ion yang lain. Proses pemisahan terjadi ketika ion - ion
bergerak turun secara berurutan eluat bersama-sama dengan
eluen dengan kecepatan yang berbeda yang tergantung pada
esarnya koefisien distribusi masing-masing ion. Perbedaan kecepatan migrasi
merupakan dasar pemisahan kromatografi. Tanpa perbedaan kecepatan migrasi tidak mungkin
terjadi pemisahan. Perbedaan kecepatan migrasi merupakan hasil distribusi
keseimbangan senyawa - senyawa fasa diantara fasa diam dan
fasa gerak.
Resin penukar ion dapat
digunakan dalam metode pemisahan atau pemekatan dengan
menggunakan penukaran kesetaraan. Resin penukar ion merupakan polimer tinggi
organik yang mengandung gugus fungsional ionik,resin ada umumnya adalah polimer
berupa butiran dengan berbagai ukuran.Butiran-butiran ini ditempatkan dalam
tabung glass yang cukup panjang sehingga menghasilkan
kolom ion penukar ion yang didalamnya akan terjadi proses penyetaraan.
Pembuatan resin adalah dengan cara memasukkan gugus yang diionisasi
kedalam matriks polimer organik, yang paling umum adalah polistirena yang
bertindak sebagai adsorben. Larutan yang melalui kolom disebut
influent,sedangkan larutan yang keluar dari kolom disebut efluen. Proses
pertukarannya ialah serapan dan mengembalikan resin yang sudah
terpakai kebentuk semula yang disebut dengan regenerasi. Sedangkan proses
pengeluaran ion dari kolomdengan reagen yang sesuai disebut elusi. kapasitas
pertukaran total ialah jumlah gugusan-gugusan
yang dapat dipertukarkan didalam kolom dinyatakan dalam milleknalen, kapasitas
penerobosan didefinisikan sebagai banyaknya ion yang dapat
diambil oleh kolom pada kondisi pemisahan.
Analisis elusi mempunyai berbagai keuntungan, misalkan
semua ion-ion yang akan dipisahkan meninggalkan kolom sebagai fraksi-fraksi
yang terpisah. Proses elusi terdiri dari dua, yang pertama adalah fraksi dengan
beberapa eluen dan yang kedua adalah mengelusi ion yang masih aktif. Resin
anionik adalah suatu bahan yang dapat menukar atau mengganti anion-anion yang ada
dalam medium disekitarnya. Resin-resin (sintetik) dapat berasal dari
polimer-polimer padat yang berjalinan erat secara silang dengan berat molekul
besar dapat berasal dari zat organik tertentu seperti fenol dan sterina yang
berkaitan dengan gugus tertentu yang dapat terionisasi serta bersifat basa,
misalnya gugus amina atau fenol atau aluminium kuartener yang ditambahkan pada
resin polifeniletana yang stabil.
Prinsip dasar resin penukar anion adalah dapat ditukarnya
anion hidroksil oleh anion lain yang terjadi pada resin penukar ion. ada dua jenis
penukaranion yaitu resin yang memiliki gugus basa kuat (gugus amonium kuartener) dan resin yang
memiliki gugus basa lemah (gugus anion). Permukaan basa kuat dapat digunakan
diatas rentangan pH 0 sampai 12,sedangkan resin penukar basa lemah hanya diatas
rentangan pH 0 sampai 9.Golongan penukar basa lemah tidak akan melepaskan asam
yang sangat lemah,tetapi lebih disukai untuk asam kuat yang mungkin tertahan
oleh resin basa kuat seperti sulfanol.Proses pertukaran ion merupakan proses kompetisi
antara ion solut yang terdapat dalam fase mobil dengan ion lawannya yang
terikat pada gugusfungsional pada matrik yang bermuatan berlawanan. Hal ini
berarti ion solut harusdapat menggantikan satu atau lebih
ion lawan yang terikat oleh fasa stationer (matrik). Bila kita mempunyai
penukar ion yang bermmuatan positif atau penukar kation yang telah mengikat ion
lawan dalam fase mobil yang terdapat pada ionsolut maka proses pertukaran ion
dapat beraksi.
3. KROMATOGRAFI
AFINITAS
Pemurnian
enzim atau protein menggunakan teknik kromatografi afinitas pada saat ini
sangat populer dan menjadi pilihan utama. Pemurnian ini dilakukan berdasarkan afinitas enzim
atau protein terhadap biomolekul lain (ligan), misalnya enzim terhadap inhibitor,
substrat atau produknya, afinitas antibodi terhadap antigennya, atau afinitas
hormon terhadap reseptornya.
Prinsip kromatografi afinitas adalah pengikatan spesifik
ligan dengan reseptor. Jadi, dalam kromatografi afinitas minimum harus ada dua
senyawa yang berikatan spesifik. Dalam proses pemurnian satu tahap menggunakan
kromatografi afinitas diperlukan interaksi spesifik antara protein rekombinan
dengan suatu ligan. Keterbatasan metode ini adalah protein rekombinan
yang akan dimurnikan harus berinteraksi secara spesifik dengan suatu ligan.
Jadi, jika tidak diketahui ligan yang dapat berinteraksi secara spesifik maka tidak
dapat dilakukan pemurnian satu tahap.
Ciri yang menonjol pada kromatografi afinitas
adalah kemampuannya untuk secara selektif mengeluarkan satu protein
tertentu, atau yang paling sering,sejumlah kecil protein tertentu, dari
campuran protein yang kompleks. Teknik ini menggunakan suatu ligand tak bergerak yang
mengadakan interaksi spesifik dengan enzim yang ingin dimurnikan. Protein yang
tidak di kehendaki akan mengalir lewat kolom dan dibuang. Protein yang di
kehendaki kemudian akan dielusikan dari ligan yang tak bergerak memakai cairan
elusi yang umumnya berupa larutan garam atau ligand berbentuk larut dengan
konsentrasi tinggi. Permunian yang dicapai melalui teknik kromatografi afinitas ini
sangat mengesankan dan sering melebihi hasil yang mungkin di peroleh dengan
pemakaian sejumlah teknik klasik secara berturutan
Langganan:
Postingan (Atom)
